ПЦР: почему праймеры направлены навстречу друг другу

Чтобы выбрать праймеры для ПЦР, недостаточно заменить A на T, а G на C. Нужно ещё учесть направление двух цепей ДНК. Разберём, где связывается каждый праймер, откуда полимераза начинает синтез и как записать обе последовательности без ошибки.

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, позволяет получить много копий выбранного участка ДНК. Этот процесс называют амплификацией, а полученный фрагмент — ампликоном. Например, из длинной молекулы можно копировать только тот участок, границы которого заданы парой праймеров.

Для обычной ПЦР нужны ДНК-матрица, два праймера, термостабильная ДНК-полимераза и свободные нуклеотиды — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, или dNTP. Реакцию проводят в подходящем буферном растворе с ионами магния. Температуру меняет прибор — амплификатор.

Праймер — короткая одноцепочечная молекула ДНК. Она связывается с комплементарным участком матрицы: A образует пару с T, G — с C. Полимераза продолжает уже начатую цепь, присоединяя нуклеотиды к свободной 3′-OH-группе праймера. Поэтому праймер не просто обозначает место старта: он входит в состав новой цепи.

Денатурация. При нагревании две цепи ДНК разделяются. Каждая из них может служить матрицей для синтеза новой цепи.

Отжиг. Температуру понижают, и праймеры связываются с подходящими участками матриц.

Элонгация. Полимераза удлиняет связанные праймеры, подбирая нуклеотиды по последовательности матрицы.

Циклы повторяются: синтезированные молекулы тоже становятся матрицами, и число копий целевого участка растёт. Температуры и время этапов выбирают под конкретные праймеры, фермент и состав реакции. Иногда отжиг и удлинение совмещают в один температурный этап, поэтому трёхэтапная схема — базовая модель, а не единственный режим ПЦР.

У цепи ДНК есть направление. Обозначения 5′ и 3′ связаны с нумерацией атомов углерода в сахаре — дезоксирибозе. Для выбора праймеров нужно помнить два правила: цепи ДНК антипараллельны, а новая цепь растёт только в направлении 5′ → 3′.

Если верхняя цепь идёт слева направо от 5′ к 3′, нижняя направлена от 3′ к 5′. Полимераза добавляет нуклеотиды к 3′-концу новой цепи и движется по её матрице в противоположном направлении: 3′ → 5′. Эти направления нельзя менять местами.

Рассмотрим участок с верхней цепью, записанной слева направо как 5′ → 3′. Прямой праймер обозначим F, обратный — R.

Прямой праймер F связывается с нижней матрицей у левой границы нужного участка. Его 3′-конец расположен справа, поэтому новая цепь удлиняется вправо.

Обратный праймер R связывается с верхней матрицей у правой границы. Его 3′-конец расположен слева, поэтому новая цепь удлиняется влево.

На рисунке направления удлинения оказываются встречными. При этом оба процесса идут по одному химическому правилу: новая цепь всегда растёт 5′ → 3′. Сами праймеры не перемещаются навстречу друг другу — полимераза достраивает цепи от их 3′-концов.

При повторении циклов накапливаются копии фрагмента, ограниченного выбранной парой праймеров. В обычной ПЦР без добавочных последовательностей на 5′-концах праймеров оба праймерных участка входят в ампликон. В первых циклах могут появляться и более длинные продукты, выходящие за одну из его будущих границ.

Последовательности обоих праймеров принято записывать от 5′ к 3′. Возьмём учебный участок:

Многоточие заменяет середину участка. Для простоты выберем праймеры по шесть нуклеотидов. Это учебное упрощение, а не рекомендация для лаборатории: в реальном подборе обычно используют более длинные праймеры и проверяют их свойства.

Прямой праймер связывается с началом нижней матрицы — участком 3′–TGCAGT–5′. Комплементарная ему последовательность праймера:

Она совпадает с началом верхней цепи, потому что праймер связывается с противоположной, нижней цепью. Его 3′-конец смотрит вправо, внутрь выбранного участка.

У правой границы верхней матрицы находится участок 5′–GCTAAC–3′. Выпишем комплементарную последовательность рядом с ним, сохраняя антипараллельность:

Пары оснований получились верными, но праймер пока записан от 3′ к 5′. Для стандартной записи читаем эту же цепь с другого конца:

Такую последовательность называют обратно комплементарной исходному участку. Мы сначала получили комплементарную цепь, затем изменили направление её записи. Одной замены букв для обратного праймера недостаточно.

Забыть про концы цепей. Буквы могут быть комплементарными, а запись — неверной. Сначала подпишите 5′ и 3′ у обеих матриц, затем у каждого праймера.

Подбирать праймеры друг к другу. Каждый должен связываться со своим участком ДНК-матрицы. Если праймеры хорошо связываются между собой, особенно в области 3′-концов, могут возникать праймер-димеры — нежелательные продукты реакции.

Искать старт- или стоп-кодон без необходимости. Эти сигналы относятся к синтезу белка. ДНК-полимераза при ПЦР их не использует как команды начала и остановки: выбор участка определяется расположением праймеров. Копировать можно и последовательность, которая не кодирует белок.

Правильная ориентация — только начало подбора. Проверяют длину праймеров, температуру плавления, связывание с нужным участком и возможное сворачивание праймера или взаимодействие между двумя праймерами. Температура плавления характеризует устойчивость пары «праймер — комплементарная цепь» и зависит от последовательности и условий раствора.

Для учебного разбора достаточно уверенно выполнять три действия: отмечать концы матриц, выбирать комплементарные участки и записывать оба праймера в направлении 5′ → 3′. После этого проверьте, откуда продолжится синтез: свободные 3′-концы должны быть обращены внутрь выбранного участка.

Автор: Валентин Игоревич Симахин, преподаватель биологии, эксперт ЕГЭ, врач-генетик.